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      流式細胞儀的簡要介紹與注意事項


      發布日期:2014-04-09

      一、流式細胞儀的檢測范圍

      1.流式細胞儀可以檢測細胞結構,包括:細胞大小、細胞粒度、細胞表面面積、核漿比例、DNA含量與細胞周期、R NA 含量、蛋白質含量。

      2.流式細胞儀可以檢測細胞功能,包括:細胞表面/ 胞漿/ 核的特異性抗原、細胞活性、細胞內細胞因子、酶活性、激素結合位點和細胞受體。

      二、流式細胞儀的臨床應用

      1.流式細胞術在腫瘤學中的應用:流式細胞術可以檢測腫瘤細胞增殖周期、檢測腫瘤細胞表面標記、癌基因表達產物、進行多藥耐藥性分析、檢測凋亡;

      2.流式細胞術在血液學中的應用:檢測白血病和淋巴瘤細胞、活化血小板、造血干細胞(CD34+)計數、白血病與淋巴瘤的免疫分型、網織紅細胞計數、細胞移植的交叉配型和免疫狀態監測;

      3.流式細胞術在免疫學中的應用:可以進行淋巴細胞及其亞群分析、淋巴細胞免疫分型、檢測細胞因子。

      三、流式細胞儀的科研應用

      主要有細胞動力學功能研究、環境微生物分析、流式細胞術與分子生物學研究。

      四、流式細胞術常規檢測時的樣品制備

      (一) 直接免疫熒光標記法

      取一定量細胞(約1×106 細胞/ml),直接加入連接有熒光素的抗體進行免疫標記反應(如做雙標或多標染色,可把幾種標記有不同熒光素的抗體同時加入),孵育20~60分鐘后,用PBS(pH7.2 ~7.4)洗1~2次,加入緩沖液重懸,上機檢測。本方法操作簡便,結果準確,易于分析,適用于同一細胞群多參數同時測定。雖然直標抗體試劑成本較高,但減少了間接標記法中較強的非特異熒光的干擾,因此更適用于臨床標本的檢測。

      (二) 間接免疫熒光標記法

      取一定量的細胞懸液(約1X106 細胞/ml),先加入特異的第一抗體,待反應完全后洗去未結合抗體,再加入熒光標記的第二抗體,生成抗原-抗體-抗抗體復合物,以FCM檢測其上標記的熒光素被激發后發出的熒光。本方法費用較低,二抗應用廣泛,多用于科研標本的檢測。但由于二抗一般為多克隆抗體,特異性較差,非特異性熒光背景較強,易影響實驗結果。所以標本制備時應加入陰性或陽性對照。另外,由于間標法步驟較多,增加了細胞的丟失,不適用測定細胞數較少的標本。

      五、質量控制和注意事項

      流式細胞儀并非是完全自動化的儀器,準確的實驗結果還需要準確的人工技術配合,所以標本制備需要規范,儀器本身亦需要質量控制。

      (一)流式細胞術免疫學檢測的影響因素和質量控制

      流式細胞術在免疫學中有著廣泛的應用,其免疫熒光染色的標本制備非常重要,常常由于標本制備過程中出現人為非特異性熒光干擾(尤其在間接免疫熒光染色中)或細胞濃度低等影響檢測結果。解決這些影響因素的方法如下:

      (1) 確保標本上機檢測前的濃度為1X106/ml,細胞濃度過低直接影響檢測結果。

      (2) 使用蛋白封閉劑,封閉非特異結合位點,尤其在間接免疫熒光標記時必不可少。常用的蛋白封閉劑為0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。

      (3) 熒光抗體染色后充分洗滌,注意混勻和離心速度,減少重疊細胞和細胞碎片。

      (4) 設置對照樣品,采用與抗體來源同型匹配的無關對照和熒光抗體的本底對照。

      (5)判定結果時,應注意減去本底熒光,為使免疫熒光的定量分析更精確,應用計算機程序軟件,用擬合曲線方法從實驗組的曲線峰值中減去對照組的曲線峰值,可以得到更準確的免疫熒光定量結果。

      (6) 注意染色后避光,保證細胞免疫熒光的穩定。

      (二)DNA倍體分析的質量控制仍沒有統一的標準, 各文獻報道的實驗結果差異較大,1993年10月美國癌癥研究組織制定了FCMDNA定的統一標準,我們根據這些標準并結合國內有經驗的專家多年的實踐,對FCM的DNA分析技術的質控和注意事項進行說明。

      (1) 手術切除的新鮮標本或活檢針吸標本取材時,要避免出血壞死組織。

      (2) 標本采集后要及時固定或深低溫保存,以免組織發生自溶,DNA降解,而造成測試結果的誤差。

      (3) 固定劑要采用對組織細胞穿透性強的濃度,70%的乙醇固定效果較好。

      (4) 單細胞懸液制備過程中,注意將待測細胞成分分離出來,減少其他成分的干擾,并注意不要損傷該群細胞。

      (5) 細胞樣品的采集要保證足夠的細胞濃度,即1X106/ml,雜質、碎片、團塊和重疊細胞應<2%,對腫瘤細胞DNA異倍體的分析樣品,至少有20%的腫瘤細胞存在。

      (6) 石蠟包埋組織單細胞制備時要注意:取材時應選取無自溶、壞死的組織,對腫瘤組織標本,選取含腫瘤細胞豐富的區域;石蠟組織片的厚度要適宜,**為40~50μm 。過薄或過厚的切片均會影響檢測結果;徹底脫蠟,以免殘留的石蠟影響酶的消化活性,驗證脫蠟是否完全的方法是棄去二甲苯,加入100%乙醇,如果無絮狀物浮起,說明蠟已脫凈;水化要充分,使組織還原到與新鮮組織相似的狀態;注意消化的時間和消化酶的活性。常規使用0.5%胃蛋白酶,pH 1.5。

      ( 三) 操作方面

      (1)流式細胞儀在整個工作過程中處于*佳狀態,能保證定量檢測的準確性和檢測精度。使用標準樣品調整儀器的變異系數在*小范圍,分辨率在**狀態,能避免在測量過程中儀器條件的變化引起的檢測誤差。

      (2)評價儀器精度的重要指標是儀器的變異系數(CV),對于校準樣品,其CV值越小越好,CV值越小,說明儀器校正的精度越高。校準樣品包括非生物樣品(熒光微球)和生物細胞樣品(人淋巴細胞、雞紅細胞等)。目前,非生物熒光微球已有商品試劑,CV一般<2%~3%。

      (四) 資料分析方面

      (1) 當樣品中碎片雜質或團塊過多,所測細胞數在20%以下,組方圖的基線抬高時,應放棄分析處理。

      (2) 做細胞周期分析時,樣品細胞數應在1萬個,排除碎片、雜質和團塊,當異倍體細胞數占總細胞數10%以下時,需要結合其他診斷指標,不可盲目下結論,至少異倍體細胞占總細胞數的20%以上,可以確定異倍體的存在。

      (3)DNA分析時,正常二倍體細胞組方圖CV值>8%時放棄分析,但腫瘤細胞的CV值>8%,與腫瘤細胞的異質性有關。另外,DNA倍體分析時,同源組織的不同個體會出現10%的漂移。

      (4)DNA倍體標準的質量控制,采用相同個體同源正常組織、同樣固定方法、相同的樣品處理方法、相同的染色方法、同步染色、同樣的儀器檢測條件、正常的二倍體組織作為內標準。



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